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探讨新兴的6种农业特种养殖植物肉中18种氨基酸含量的检测措施

文章泉源: 肉类研究       宣布时间:2019-06-05

零点棋牌 蓝孔雀、眼镜蛇、滑鼠蛇、海蛇、海龙和海星为我国近年来新兴的农业特种养殖植物,国家政策勉励和支持特种养殖植物的研究开发应用及家当生长,增添对野生资源的依附,具有掩护野生动物和生态意义。同时,上述6栽种物是我国传统中医药药材及特点食材。我国明朝李时珍《本草纲目》收载孔雀,曰其辟恶,解年夜毒、中毒、药毒。服食孔雀后,服药必不效,为其解毒也[1-3]。西汉《神农木草经》和唐朝《本草拾遗》纪录蛇,均曰其祛风燥湿、通络活血,用于治疗风湿痹痛、四肢麻术等。我公正易近间自古有南人嗜蛇的说法。滑鼠蛇蛇肉中所含的亮氨酸、赖氨酸、丙氨酸及缬氨酸为人体必须氨基酸,所含的谷氨酸使蛇肉幽喷喷鼻味美,还能够增强脑细胞活力,赞助影象[4-5]。眼镜蛇肉质细腻、滋味鲜美、祛风除湿、舒筋活络,主治风湿性要害炎、无名凄凉伤心等,是深受人们喜欢的可用于强身壮体的鲜味佳肴[6-7]。海蛇,味辛、咸、性平,归肝、肾经,祛风静痛、通络活血、滋补强壮等,用于治疗风湿痹病、四肢麻木、要害凄凉伤心及疥癣恶疮等[8]。海龙可降低唿吸中枢兴奋性,使唿吸运动趋于清静而泛起镇咳战斗喘作用,海龙可强精益气,主治四肢发冷、水肿的肾阳虚证[9-11]。海星可抗菌、降血压、降血糖、抗疲劳、抗炎、促骨细胞生长、抗骨质松懈及调治生殖发育等[12]。牛磺酸可以调治机体糖类和脂类代谢、增强心脏功效、增强体质、扫除疲劳和前进机体免疫力,特殊是可以刷新学习影象才干。随着现代科技和医学生长,人们日趋熟悉到这6种资源较高的养分、保健及医药价值,因其利于安康和防治疾病,市场需求赓续上升,推动了家当生长。


零点棋牌 现在,检测氨基酸的措施主要有高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)[13-15]、HPLC-勾通质谱(HPLC-tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS)[16-18]和全自动氨基酸剖析仪测定法[19-21]。全自动氨基酸剖析仪的优点[22]在于接纳在线衍生和氮气全关闭系统,可取得较高迅速度、较低检出限和较好重现性。之前未见报导用全自动氨基酸剖析仪测定蓝孔雀、眼镜蛇和滑鼠蛇肉中牛磺酸的含量,本研究应用全自动氨基酸剖析仪法测定上述6栽种物肉中网罗牛磺酸在内的18种氨基酸的含量。


1质料与措施


零点棋牌 1.1质料与试剂


人工养殖蓝孔雀肉干粉广西龙凤谷农业栽种养殖场;人工养殖眼镜蛇的活蛇样品和滑鼠蛇的活蛇样品及肉干粉样品广西灵山龙璇蛇业无限公司;海蛇、海龙、海星钦州市嘉园农商开发无限公司;将眼镜蛇、滑鼠蛇活蛇样品安乐去世,洗净并吸干外面水分,去皮及内脏,拆去蛇骨,残剩为实验用的纯蛇肉,以上样品均为6个批次。


氨基酸混淆尺度溶液(网罗天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸,共17种,除胱氨酸含量为1.25μmol/mL外,其他16种氨基酸含量均为2.50μmol/mL)德国Sigma-Aldrich公司;牛磺酸尺度物质(纯度99.0%)上海安谱实验科技股分无限公司。


零点棋牌 盐酸(优级纯)、乙酸锌、亚铁氰化钾(均为剖析纯)国药全体化学试剂无限公司;0.04 mol/L柠檬酸钠缓冲液(pH 3.45)、0.5 mol/L氢氧化钠再生溶液、样品稀释液(0.12 mol/L盐酸溶液,pH 2.20)、茚三酮(均为色谱纯)德国Sykam公司;高纯氮气(纯度99.99%)广西瑞达化工手艺无限公司;超纯水(电阻率18.2 MΩ·cm)实验室昂贵甜头。


零点棋牌 1.2仪器与装备


S433D全自动氨基酸剖析仪德国Sykam公司;XS205DU电子天平瑞士Mettler Toledo公司;G560E快速混匀器美国Scientific Industries无限公司;N-EVAP 112氮吹仪美国Organomation Associates公司;Milli-Q超纯水仪美国Millipore公司;韩国年夜韩WEB-6水浴锅苏州安创仪器无限公司;S120H超声波发生器德国Elma公司。


1.3措施


零点棋牌 1.3.1色谱条件


色谱柱:磺酸型阳离子交流树脂;划分柱:不锈钢柱(4.6 mm×60 mm,7μm),填充交流树脂,型号:No.855-3506(强酸型#2622SC-PH,日立);柱温57℃;运动相流速0.40 mL/min;回声柱:不锈钢柱(4.6 mm×40 mm,7μm),填充石英砂,型号:No.855-3523(日立);回声器温度135℃;茚三酮流速0.35 mL/min;进样量50μL;检测波长:脯氨酸在440 nm波优点测定,其他16种氨基酸和牛磺酸在570 nm波优点测定;运动相梯度洗脱法式模范模范如表1所示。

探讨新兴的6种农业特种养殖植物肉中18种氨基酸含量的检测措施

1.3.2样品前处置赏罚赏罚


眼镜蛇鲜肉和滑鼠蛇鲜肉划分取2.0 g,加入90%乙醇沉淀卵白后,加10 mL 6 mol/L HCl溶液均质破碎摧毁匀称后转移至水解管中,补足10 mL 6 mol/L HCl溶液;充入氮气将水解管中的氧气赶净后急速密封,置烘箱中110℃水解22 h后取出;放置至室温,测得其pH值约为4.9;转移至离心管中,10 000 r/min离心5 min,取上清液5.0 mL水浴蒸干,用样品稀释液复溶至5.0 mL。


蓝孔雀肉干粉、滑鼠蛇肉干粉、海蛇肉干粉、海龙肉干粉和海星肉干粉划分称取2.0 g,加入90%乙醇沉淀卵白后,加10 mL 6 mol/L HCl溶液,置于水解管中,充入氮气将水解管中的氧气赶净后急速密封,置烘箱中110℃水解22 h后取出;放置至室温,测得其pH值约为6.6;用6 mol/L HCl溶液调治pH值至5.0±0.2后转移至离心管中,10 000 r/min离心5 min,取上清液5.0 mL水浴蒸干,用样品稀释液复溶至5.0 mL。


1.3.3尺度溶液的配制


零点棋牌 周详称取牛磺酸尺度品100.0 mg,置于10 mL容量瓶中,用超纯水定容,摇匀,配制成质量浓度为10 mg/mL的尺度储蓄溶液。取牛磺酸尺度储蓄溶液1 mL置于50 mL容量瓶中,用样品稀释液定容,摇匀,配制成质量浓度为200μg/mL的尺度使命溶液,置于4℃冰箱中1个月,备用。


划分周详量取牛磺酸尺度使命溶液和氨基酸混淆尺度溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL,划分加入到10 mL容量瓶中,用样品稀释液稀释成不合质量浓度的系列混淆尺度溶液。


1.3.4氨基酸含量测定


对蓝孔雀等6栽种物肉各6个批次阻拦游离氨基酸含量测定及剖析,凭证公式(1)~(2)盘算。


1.3.5收受吸收率实验


取蓝孔雀肉干粉样品,将其作为空缺基质,加入低质量浓度混淆尺度溶液(16种氨基酸质量浓度为6.4 mg/L,胱氨酸质量浓度为3.2 mg/L,牛磺酸质量浓度为4.0 mg/L)和高质量浓度混淆尺度使命溶液(16种氨基酸质量浓度为12.8 mg/L,胱氨酸质量浓度为6.4 mg/L,牛磺酸质量浓度为8.0 mg/L),凭证1.3.2节的措施处置赏罚赏罚样品,划分阻拦3次平行实验,测定照顾的峰面积,盘算匀称收受吸收率和相对尺度误差(relative standard deviation,RSD)。


零点棋牌 1.3.6周详度实验


零点棋牌 周详罗致统一批蓝孔雀样品溶液,凭证1.3.1节中的色谱条件,进样50μL,平行测定5次。划分测定18种氨基酸的含量,盘算RSD,考察措施的周详度。


零点棋牌 1.3.7稳固性实验


零点棋牌 周详罗致统一批蓝孔雀样品溶液,在0、2、4、6、8 h各进样50μL,划分测定18种氨基酸的含量,盘算RSD,考察措施的稳固性。


零点棋牌 1.3.8重复性实验


匀称称取蓝孔雀样品6份,每份1.00 g,凭证1.3.2节的措施处置赏罚赏罚样品,划分测定18种氨基酸的含量,盘算RSD,考察措施的重复性。


2效果与剖析


2.1样品前处置赏罚赏罚条件的优化


眼镜蛇鲜肉和滑鼠蛇鲜肉均为鲜肉样品,盘算效果按干基折算。经由重复实验,鲜肉样品的pH值为6.1,肉干粉样品性状曾经为干基,肉干粉的pH值为6.8,凭证氨基酸剖析仪特点和氨基酸结构特点,最后上机样品需为酸性,pH值3.5~4.5,此时对氨基酸的划分效果较量好。


零点棋牌 2种基质基线无差异,均较毛躁


零点棋牌 由表2可知,鲜肉和肉干粉水解后的状态不合,酸碱性不合,氨基酸水解出来的水平也会不合,是以样品经由水解后的水解液须要测定pH值。同时,岂论鲜肉还是肉干粉,样品自己均含卵白质、脂肪等年夜分子物质,若上机前不阻拦去除,杂质会滋扰目的峰,影响积分,组成定量不准确。是以,本研究接纳2种不合的样品前处置赏罚赏罚措施阻拦考察。

探讨新兴的6种农业特种养殖植物肉中18种氨基酸含量的检测措施

零点棋牌 措施1:现在,去除卵白质的经常应用溶剂为乙酸锌和亚铁氰化钾溶液[23-25],本研究考察这2种沉淀剂对鲜肉样品和肉干粉样品中卵白质的沉淀效果[26-28]。称取样品1.0 g,划分加入上述2种沉淀剂。由表2可知,乙酸锌和亚铁氰化钾溶液能够很好地去除卵白质。去除卵白质等杂质后的样品加入10 mL 6 mol/L HCl溶液阻拦水解[29-31]。


措施2:老例氨基酸剖析仪用90%乙醇溶液对鲜肉样品和肉干粉样品中的卵白质等年夜分子物质阻拦沉淀去除,效果如表2所示。去除卵白质后的样品经由氮吹干,加入10 mL 6 mol/L HCl溶液,置于水解管中阻拦水解。


措施1中的乙酸锌和亚铁氰化钾溶液虽然卵白质沉淀效果较好,但是经由上机发现,各氨基酸的基线不稳,较量毛躁,且目的峰照顾值不高,仍有部门杂质峰滋扰,启事能够是乙酸锌和亚铁氰化钾影响色谱柱对目的峰的划分。本研究所用色谱柱为阳离子交流柱,上述2种沉淀剂均含有阳离子,会使得色谱柱柱效降低,进而招致游离氨基酸总量检测不准确。措施2中年夜部门卵白质在90%乙醇中变性,再经由酸水解后也能去除一部门卵白质,使氨基酸肽链断开,各氨基酸基线结实,目的峰照顾值较高,峰形较好,杂质滋扰少。综上所述,本研究接纳措施2阻拦样品前处置赏罚赏罚。


2.2措施的线性关系及检出限


零点棋牌 2.3措施收受吸收率、周详度、稳固性及重复性

探讨新兴的6种农业特种养殖植物肉中18种氨基酸含量的检测措施

由表3可知:低质量浓度条件下的加标收受吸收率为96.11%~109.76%,RSD为0.14%~1.62%,高质量浓度条件下的加标收受吸收率为96.12%~104.13%,RSD为0.11%~1.88%;周详度RSD为0.08%~0.94%;稳固性RSD为0.16%~0.97%;重复性RSD为0.09~0.91%。注解此措施的准确性高,周详度、稳固性及重复性均较好。


2.4样品测定效果


鲜肉所含水分对检测效果会有影响,以是鲜肉的氨基酸和牛磺酸含量事实效果均按逝世板品盘算。经由历程实验,测得眼镜蛇鲜肉和滑鼠蛇鲜肉的水分含量划分为67.85%和69.51%,可见鲜肉中所含水分较年夜会招致样品效果差异也较年夜,是以在阻拦效果盘算时,应扣除水分后取得准确效果。


蓝孔雀和滑鼠蛇鲜肉和海蛇肉干粉的氨基酸总量和牛磺酸含量均较高,虽然不合样品的氨基酸总量和牛磺酸含量有所不合,但效果均高于措施检出限,是以,这些样品行料所含因素具有一定的药用价值,对往后保健品行业也有一定的参考作用。


3结论


零点棋牌 本措施培植在全自动氨基酸剖析仪基础上,对6种农业特种养殖植物肉的药用价值阻拦探讨,检测出18种氨基酸,能够为保健品行业供应很好的数据质料。同时,本措施操作质朴、便捷、适用性强,完成了全自动氨基酸剖析仪对蓝孔雀、眼镜蛇、滑鼠蛇、海蛇、海龙及海星肉中18种氨基酸含量的快速测定,为往后检测蓝孔雀肉、海蛇肉等植物的网罗牛磺酸在内的18种氨基酸含量供应了参考凭证。


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